Подготовка к исследовательской работе
Выделение изолятов Phytophthora infestans в чистую культуру
Возбудитель фитофтороза
Возбудителем фитофтороза является оомицет Phytophthora infestans.
Оомицет P. infestans можно выделить в чистую культуру с любого органа картофеля или томата, пораженного фитофторозом (лист, стебель, клубень, плод), а также из почвы.
Оомицет P. infestans можно выделить в чистую культуру с любого органа картофеля или томата, пораженного фитофторозом (лист, стебель, клубень, плод), а также из почвы.
Выделение изолята с листьев или стеблей
Подготовка листьев (стеблей) — пораженные фитофторозом листья или стебли дезинфицируют в слабом растворе KMnO4 (0,45 г/л) и тщательно промывают в стерильной воде.
Подготовка клубней для "гамбургеров" — вымытые клубни восприимчивого сорта картофеля протирают спиртом, обжигают над пламенем спиртовки и разрезают на ломтики толщиной 0.8 см, которые затем надрезают (см. фото).
В надрезы полученных ломтиков вкладывают подготовленные поражённые листья, раскладывают в увлажненные чашки Петри и выдерживают 3-5 дней при температуре 20-25 С.
Появившийся на 3−5 день мицелий с помощью иглы переносят в пробирки с агаризованной питательной средой (ржаной или овсяной — см. «Методика поддержания, сохранения и наработки изолятов Phytophthora infestans») в количестве не менее 10 пробирок.
Подготовка клубней для "гамбургеров" — вымытые клубни восприимчивого сорта картофеля протирают спиртом, обжигают над пламенем спиртовки и разрезают на ломтики толщиной 0.8 см, которые затем надрезают (см. фото).
В надрезы полученных ломтиков вкладывают подготовленные поражённые листья, раскладывают в увлажненные чашки Петри и выдерживают 3-5 дней при температуре 20-25 С.
Появившийся на 3−5 день мицелий с помощью иглы переносят в пробирки с агаризованной питательной средой (ржаной или овсяной — см. «Методика поддержания, сохранения и наработки изолятов Phytophthora infestans») в количестве не менее 10 пробирок.
Выделение изолята из почвы
- Отберите пробы в 10 различных точках поля – в каждой точке с поверхности, на глубинах 10-15 и 20-25 см. В сумме 2,5-3,0 кг.;
- Все образцы с поля тщательно перемешайте и разделите на субобразцы весом не менее 100г. К каждому субобразцу добавьте по 100мл стерильной или кипячёной воды, и смешайте до образования кашеобразной массы;
- Возьмите здоровые клубни картофеля (желательно восприимчивых к фитофторозу сортов), тщательно помойте их, высушите и нарежьте ломтиками толщиной 0,5-0,7 см.
- На каждый ломтик нанесите смешанный с водой субобразец из расчета 0,5-1,0г на ломтик (сделайте "бутерброд" из ломтика картофеля с тонким слоем кашеобразного субобразца);
- Ломтики картофеля разложите на поддоны и поместите во "влажную камеру" - плотно закрытый ящик или ёмкость, в которой помимо образцов находятся влажные ватные тампоны или намоченная промокательная бумага. Выдержите образцы во влажной камере 5-7 дней в темноте при t=18-20°С;
- Появление через 5-7 дней мицелия указывает на присутствие в почве источников фитофтороза.
Выделение изолята с клубней
Для выделения P. infestans с больных клубней используют клубни, пораженные не более чем на 50%. Пораженные клубни тщательно промывают, протирают спиртом, обжигают над пламенем спиртовки, разрезают на ломтики толщиной 0,6-0.8 см., раскладывают в увлажненные чашки Петри и выдерживают 3-5 дней при температуре 20-25 С.
После появления мицелия выделение патогена проводят по вышеописанной методике (см. "Выделение изолята с листьев")
После появления мицелия выделение патогена проводят по вышеописанной методике (см. "Выделение изолята с листьев")
Методика поддержания, сохранения и наработки изолятов Phytophthora infestans
Изоляты P. infestans поддерживают в жизнеспособном состоянии методом многократных пересевов на пробирки с питательной средой (овсяную или ржаную). Ниже приведены составы сред и их приготовление. Пробирки с культурами хранят в холодильных камерах при температуре +10-12оС. Такой способ сохранения культур позволяет проводить пересев один раз в 3-4 месяца. Для оценки уровня агрессивности изолятов P. infestans используют 10-14 дневную культуру оомицета.
Ржаная питательная среда (по Кейтену)
60 г семян ржи замачивают в 1 л дистиллированной воды на 36 ч. Разбухшие семена кипятят в течение 1 часа, затем фильтруют через несколько слоев марли, осадок выбрасывают. Исходную жидкость после намачивания зерен добавляют к фильтрату вместе с 15 г агара и 20 г сахарозы и доливают до 1 л воды. Среду автоклавируют при 1 атм 40 мин.
Овсяная питательная среда
20 г овсяной муки (геркулес или овсяная крупа) варят в 1 л водопроводной воды 20 мин, после чего фильтруют и доводят водопроводной водой до 1 л. Добавляют 20 г агара, доводят рН до 6.9 – 7.0 и стерилизуют при 0.6 атм 30 мин.